前言

细胞计数是细胞培养过程中的重要步骤，“金标准细胞计数方法”是在显微镜下使用血细胞计数板人工计数。这里博大博聚给大家介绍下金标准细胞计数的详细的步骤，供大家参考。

1、准备好血细胞计数板

1) 先用无水乙醇清洁血细胞计数板表面和盖玻片；

2) 再用纯水清洁血细胞计数板表面和盖玻片；

3) 每次清洗后用洗耳球吹干。

4) 在血细胞计数板的计数池上方盖上专用的盖玻片。

注意：最好不要擦拭血细胞计数板的计数池，防止标识线损坏。

2、制备细胞悬液

1) 贴壁生长的细胞，使用胰酶消化的方法使细胞从培养瓶表面脱落；

2) 漩涡混匀或使用移液器反复吹吸细胞悬液，尽量减少细胞团簇；

3) 悬浮细胞则可以直接进行取样计数；

4) 细胞悬液的计数浓度：5×105个细胞/m L -5×106个细胞/m L。

注意：

a) 尽量少、尽量小的细胞团簇； 

b) 如需计算活率，则需将细胞悬液按照1：1的比例加入等量的0.4%的台盼蓝染料，混匀后，静置1~2分钟。  
    

3、细胞加样

1) 移液器轻吹细胞悬液使其混合均匀；

2) 将细胞悬液与台盼蓝染料按1:1体积混合均匀；

3) 取出10uL细胞悬液，将细胞悬液滴加于血细胞计数板边缘凹槽处，此时液滴将在虹吸的作用下进入盖玻片下方的计数池。

注意：

1) 每次加样前要混匀细胞悬液，防止细胞沉降造成取样误差增大；

2) 加样过程中，要一次性将细胞悬液注入计数室，防止气泡产生，否则要重做；

3) 加样时不要将细胞悬液直接吹入计数池，会造成细胞分布不均匀。

4、 人工细胞计数

计数工具：10X物镜的显微镜、血细胞计数板。

1) 加样后，将血细胞计数板静置数分钟；

2) 把血细胞计数板放置在显微镜的载物台进行观察-计数-记录；

3) 分别计数大方格1-2-3-4中的细胞总数。

注意：

1) 计数时建议重复1-2次，取平均值，减小计数误差；

2) 四个区域的细胞数量偏差不应超过 5%，否则要重新加样。

3) 对横跨刻度上的细胞，依照“数上不数下，数左不数右”的原则进行计数。

4) 为降低细胞计数误差，浓度最好控制在5×105个细胞/ml以上（每个大方格有50个以上细胞）；

5) 计数时，只计数完整的细胞，如有聚团细胞则按一个细胞进行计数。

5、 血细胞计数板浓度计数标准

（中国的标准：JJG 552-1988血细胞计数板试行检定规程）

1) 如上图所示，当血细胞计数板放上盖玻片后，平台与盖玻片之间的距离 (即高度)为 0.1mm；

2) 平台中心部分各以3mm长，3mm宽精确划分为9个大方格，称为计数室，每个大方格面积为1mm2，体积为 0.1mm3；

3) 细胞浓度 (mL)=(四个大方格细胞数之和)/4X2（染液稀释倍数）X 104=？个细胞/mL。

    注意：

1) 如果不加入台盼蓝染料，则无需乘以2。

相信有些小伙伴，即使花费很长时间熟悉，并实际接触细胞计数操作的全部流程后，还是会有结果不满意、人工操作效率低、结果无法一目了然、细胞计数数到“眼疼”的情况。

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7、血细胞计数板上机实拍图案例

8、细胞计数结果包括

总细胞浓度、活/死细胞浓度、活/死细胞比率、总细胞聚团率/浓度、活细胞聚团率/浓度、死细胞聚团率/浓度等计数结果、原始图片、识别图片、柱状图、散点图、等高线图、报告单等…

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